初发酵实验 发酵管内装有单倍或三倍乳糖蛋白胨培养液，并在内倒置有小玻璃管。每个样品用三个不同的水样量接种，同一接种水样量要有五管，将水样分别接种到装有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，在37℃±0.5℃下培养24h±2h。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖并产酸产气???培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂，细菌产酸后，培养液即由原来的紫色变成黄色。产酸产气的发酵管表明试验阳性，如在倒管内产气不明显，可轻拍发酵管，有小气泡升起为阳性。

    复发酵实验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环将培养物(2-3环)转接到EC培养液中，在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h(提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长)。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。

    2.滤膜法

    滤膜是一种微孔性滤膜，孔径0.45μm。将水样注入已灭菌的放有滤膜的过滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，在44.5℃±0.5℃下培养24 h±2h。粪大肠菌群菌落在M-FC培养基上呈蓝色或蓝绿色，其他非粪大肠菌群菌落成灰色、淡黄色或无色。正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用，在M-FC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落。

    二.两种方法的注意事项

    1.培养温度的要求 总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的zui合适温度为25℃左右，如在37℃培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44.5℃，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44.5℃仍可继续生长。因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分，两种方法也都基于此理。将接种好的样品或装有滤膜的培养基放入生化培养箱时，箱内温度一定要达到所要求的温度(44.5±0.5℃)时，方可放入。如用恒温水浴箱时，其水面要高于接种物面，放滤膜的培养皿要沉到水浴箱底部。

    2.加氯水样的处理 经氯处理消毒过的水样，水中含有一定量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态，在采集水样时应提前在采样瓶中加硫代硫酸钠，硫代硫酸钠可以脱氯，使受损的细菌得以复苏与修复，从而避免出现计数结果偏低甚至假阴性的现象。此外余氯对滤膜法培养的细菌其抑制作用尤为明显，所以抽滤时应对水样进行大量无菌水稀释，以减少余氯的残留。

    3.样品的保存采样用的容器使用前应盖好瓶盖，用牛皮纸将瓶盖和瓶颈处包裹好，置干燥箱160℃-170℃干热灭菌2h，或用高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min。采样后水样的正确保存也很重要，如保存不当可使样品中的大肠菌群细菌死亡或在一定条件下再生长，这些都将影响检测结果的准确性。检测室接到水样后，应立即检测，如因故不能检测时，应立即将样品置于冰箱内(2℃-10℃)并于2小时内检测。

    4.培养物质的制备与保存

    ⑴.多管发酵法所使用的培养液在分装于各发酵管中后，应将发酵管尽快放于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min(注意：这个温度也应控制好，既达到灭菌的作用，还要防止培养物质分解流失)，然后贮存于冰箱或暗处备用。

    ⑵.滤膜法所采用的M-FC培养基多使用外购的成品，培养基中苯胺蓝的纯度和质量往往影响菌落的颜色，因此，无菌包装的成套培养基在使用前，先接种典型粪大肠菌，以观察对比菌落的颜色，来鉴定其稳定性。

    5.结果统计

    ⑴.多管发酵法的结果是根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从MPN表中查得相应的MPN指数，来计算每升水中粪大肠菌群细菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的缩写，指zui大可能数，它是根据统计学理论，估计水体中的菌群密度和卫生质量的一种方法，所以准确判断不同接种量发酵管的阳性数是非常重要的，否则将导致较大偏差。

    ⑵.滤膜法的结果是计数滤膜上呈蓝或蓝绿色的菌落，来计算出每升水样中的粪大肠菌群数。所以为便于计数，减少误差，理想的水样体积是一片滤膜上生长20-60个粪大肠菌群菌落。