一、实验准备
1、健康的HEK 293T细胞,一般使用复苏后10代以内的细胞进行慢病毒的生产,要求无细菌、真菌以及支原体污染;
2、转染试剂,如PEI、Higene、lipo2000或lipo3000
各种转染试剂的步骤稍有差别,小助手以PEI为转染试剂。
3、DMEM无血清无双抗培养基、DMEM培养基(10%FBS和1%P/S);
4、10mL无菌注射器(环氧乙烷灭菌处理);
5、0.45μm的细菌滤器。
二、包装步骤
Day1
(7:00 PM)铺板HEK 293T细胞
数量:400万/10 cm dish ;觉得计数麻烦的话,可以在293T细胞长到约90%汇合时,1:5传代(均分成5份),每1份的数目差不多就是400万了。
Day2
(3:00 PM)三质粒转染
在培养箱中恢复细胞状态约20h,此时可进行转染。三质粒的转染体系三种质粒的配比有许多种方式,目前MDL使用4:3:1的比例,即PxpAx2:PMD2g:PLVX(载有你基因的质粒)。10cm dish一般转染质粒的总质量为20μg,PEI的量为质粒的2.5-3倍(也就是50μg-60μg,一般推荐按照2.5倍来)。按照比例算下来,PxpAx2:PMD2g:PLVX的质量比为:(10ug:7.5ug:2.5ug)
注意:在提到质粒的量时,千万记得说质量而不是浓度,不然容易出错。
实验步骤:
取如上总质量为20μg的质粒添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中,记为A液,移液枪混匀20次;
取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg(也就是50-60μL)添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中,记为B液,移液枪混匀20次;
将B液逐滴滴加到A液中,移液枪轻柔混匀66次,室温静置15-20min;
将静置好的转染试剂(A+B)缓缓滴加到恢复状态20h的HEK 293T细胞中。
做好标记,记好转染时间、转染质粒、换液时间等参数提高实验重复性。
Day3
(9:00 AM)换液
转染后的第18h,将含有转染试剂的HEK 293T上清更换为10mL DMEM培养基;对于新手,为了防止在换液时将细胞吹散,可以留3mL的液体在dish中,更换8mL DMEM培养基。
Day4
(3:00 PM)收集病毒液
在转染后的48-72h,为病毒生产的高峰期,一般我们收集转染后48h(换液后30h,产毒30h)的病毒液用于实验,足以满足大部分实验需求。收集病毒于15mL tube中,500g,5mL离心去细胞碎片和杂质,随后使用注射器和滤器进行过滤。收集后的病毒上清可以用来进行感染和储存。
三、慢病毒滴度测定
病毒滴度的单位为:TU/mL,代表每毫升病毒液中具有转导功能的病毒颗粒的数目。
计算公式为:滴度=(感染时细胞数(个)*阳性细胞%)/病毒液体积(mL)
病毒液体积和感染时细胞数已知,需通过流式细胞术确认阳性细胞百分比。
滴度测定常常使用HEK 293T细胞,大致的原理为,将在DAY3收集到的病毒上清,按照梯度添加到293T细胞中,感染后48h检测阳性细胞的比例,从而确定病毒的滴度。
四、注意事项
293T细胞的代数最好用15代以内,最多不超过20代,否则影响转染效率。质粒浓度在400-1000ng/μL范围,纯度260/280在1.8-2.0之间的转染效率较高。混合体轻轻滴入细胞上清后摇匀,动作要轻,293T细胞贴壁不牢避免细胞脱落。
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