骨肉瘤(osteosarcoma,OS)属于起源于间充质的一种恶性骨肿瘤,是儿童与青少年罹患原发性恶性骨肿瘤疾病谱中最常见的。骨肉瘤患者的年龄分布呈现双峰状态,分别为青春期人群与老年人群。青春期高峰集中在大约15岁。0~24岁组的骨肉瘤发病率为4.4/百万。第二个峰值集中在75岁左右,主要由与佩吉特病或其他骨性病变相关的继发性骨肉瘤组成。男性与女性的发病率之比为1.22:1。转移仍然是骨肉瘤最重要的致命性并发症,约有80%的骨肉瘤患者在确诊时发现已存在转移性或微小转移性病灶。由于治疗原则和化学疗法的进展,患者的5年生存率从不到30%提高到70%以上。

尽管有了上述进展,但骨肉瘤发生发展的生物学机制研究仍任重而道远,如何从根源上治愈骨肉瘤是当今医学界面临的难题之一。整合素连接激酶相关磷酸酶(integrin-linked kinase-associated phosphatase,ILKAP)是一种丝氨酸/苏氨酸(S/T)磷酸化酶,与细胞的生存和凋亡有关。ILKAP同时也是一种具有调控肿瘤发生发展功能的抑癌基因表达产物。ILKAP广泛表达于人体组织中,主要在肾脏、骨骼肌、肝脏等脏器中表达水平较高。介导细胞凋亡是ILKAP的主要生理功能。

ILKAP与肿瘤细胞的发生、发展息息相关。低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是肿瘤微环境与肿瘤病因学研究中的重点。作为一种转录因子,HIF-1有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等一系列作用。HIF-1的含量一旦失调,细胞将具备多种恶性能力并演变成肿瘤。早期研究认为,细胞在正常微环境下,HIF-1主要受羟化酶的调节而进入泛素降解途径,而仅当细胞处于低氧条件时HIF-1不能被降解,进而发挥功能。近年来随着对HIF-1调节方式的深入研究,人们发现羟化反应并不是HIF-1转录活性调节的途径,磷酸化调节也是调控HIF-1的一种重要方式,尤其是在非低氧条件下。

研究目的:证实低氧可导致细胞发生凋亡；研究低氧条件下ILKAP通过与HIF-1α相互作用,对骨肉瘤细胞凋亡产生的相关影响。

研究方法:

1、细胞低氧模型的构建与监测:使用气套式二氧化碳培养箱将骨肉瘤细胞进行培养。连续从0h至96h将气罐中充入了混合的O_2(1%)与N_2(94%)和CO_2(5%)。

调节气套式二氧化碳培养箱的温度(37°C)、湿度(95%)。每24h更换细胞培养液。通过YSI模型55溶氧测定仪来监测培养箱内溶氧量,从而监测低氧环境。

2、骨肉瘤细胞活力测定:台盼蓝染色试验测定细胞存活率。将单细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。每0.1 mL单细胞悬液中加入一滴台盼蓝染液,室温下染色3~5 min,记录活细胞和死细胞数。将处理过的骨肿瘤细胞材料在高倍镜下观察。分别计数1000个细胞内的活细胞和死细胞数,统计未染色细胞,用公式计算细胞存活率。

3、骨肉瘤细胞凋亡检测:本实验采用激光共聚焦显微镜技术通过观察骨肉瘤细胞内DAPI与TUNEL的共定位,判断骨肉瘤细胞是否经历凋亡。

4、检测HIF-1α、细胞凋亡标记物:采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)—底物化学发光ECL法。

5、研究ILKAP在导细胞凋亡过程中的作用:采用ILKAP shRNA腺病毒转染与Ad-ILKAP过表达的研究方法。6、研究HIF-1α、ILKAP、p53之间的相互作用:对细胞进行了72h低氧处理,而后进行免疫共沉淀实验。研究结果:1、细胞活力随着时间延长而下降,细胞凋亡增加(P<0.05)。HIF-1α随低氧处理时间延长逐步被诱导,磷酸化HIF-1α逐渐减少。通过400U ILKAP处理HIF-1α,PBS作为阴性对照,400Uλ磷酸酶作为阳性对照,发现ILKAP和λ磷酸酶对于HIF-1α的作用相似,可使去磷酸化HIF-1α逐渐增多。2、低氧条件下细胞存活由ILKAP shRNA维持。低氧条件下细胞凋亡与ILKAP有关。

相同低氧时间下,ILKAP shRNA组的细胞凋亡数明显少于对照组(P<0.05)。Western blot条带显示HIF-1α在ILKAP shRNA组与对照组比较,大部分没有转为去磷酸化形式。3、通过免疫共沉淀实验发现,磷酸化形式的HIF-1α优先与抗ILKAP抗体免疫沉淀,去磷酸化形式的HIF-1α优先与p53抗体免疫共沉淀,ILKAP与p53之间没有相互作用。4、相比于对照组,Ad-ILKAP组的细胞存活率显著减少,呈时间依赖性(P<0.05)。细胞凋亡标记物和TUNEL法在Ad-ILKAP组相比于对照组,反映出显著增加的细胞凋亡现象。常氧条件无法诱导HIF-1α表达,但在Ad-ILKAP组可检测。

结论:1、细胞凋亡数量会随着低氧处理时间延长而显著增加。ILKAP可以起到类似于λ磷酸酶的去磷酸化作用。HIF-1α磷酸化状态在持续的低氧诱导细胞凋亡过程中发生改变,ILKAP可使HIF-1α从磷酸化状态转为去磷酸化状态。2、长时间低氧诱导情况下,下调细胞内ILKAP表达,则细胞凋亡减少。由此可见,ILKAP在长时间低氧诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用。3、ILKAP结合磷酸化形式的HIF-1α使其去磷酸化,然后与去磷酸化形式的HIF-1α分离,去磷酸化的HIF-1α则与p53结合。ILKAP不与p53直接作用。4、常氧无法诱导HIF-1α表达。在常氧情况下,上调细胞内ILKAP表达可诱导细胞凋亡,并且使HIF-1α去磷酸化。综上所述,ILKAP直接使HIF-1α去磷酸化,并且对后续p53依赖的细胞凋亡发挥重要作用?？悸堑狡溆雙53及p53本身的复杂作用,我们现阶段的实验结果为进一步研究不同HIF-1α类型在多种疾病中的作用基因奠定了基础。