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靶細胞殺傷實驗:LDH法

更新時間:2021-07-13  |  點擊率:1331

一、效應細胞的制備

 

激惹5天后,于無菌條件下取出受鼠引流的腹股溝淋巴結,100目鋼網研磨,調整細胞濃度為2×107.ml-1。臺盼藍色要求存活率>95%。

 

二、靶細胞的制備

 

P815細胞株系DBA/2小鼠的肥大細胞瘤細胞株。連續傳代培養,調整細胞濃度為2×105/ml或3.33×105/ml(加入α-Lyt2 mAb時的靶細胞濃度),臺盼藍染色成活率>95%。

 

三、LDH釋放法測定CTL的功能

 

按表1加樣于96孔培養板中,設3個復孔。混勻置二氧化碳培養箱中孵育4h。室溫離心,用微量加樣器每孔取上清液100μl,送全自動生化分析儀測定每孔的LDH含量。

 

表1 LDH釋放法測定CTL活性的加樣情況(μl)

分組效應細胞靶細胞α-Lyt2 mAb1% Triton X-100*培養基
自然釋放孔 100  100
最大釋放孔 100 100 
實驗孔1100100   
實驗孔2100 60①40  

 

 

注:靶細胞濃度為3.33×105/ml

四、計算CTL活性

特異殺傷率(%)=(實驗孔LDH值-自然釋放孔LDH值)/(最大釋放孔LDH值-自然釋放LDH值)

 

五、統計學處理

DTH的測定,4組間比較采用方差分析,兩組比較采用q檢驗。對于CTL的特異殺傷率,先進行百分數的平方根反正弦轉換后采用方差分析進行4組間比較,兩兩比較采用q檢驗。

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