实验试剂

人类胚胎肾（HEK）293T细胞

腺病毒转移载体质粒

腺病毒包装载体PLP1，pLP2（之前），PLP / VSVG

DMEM培养基

青霉素，链霉素-谷氨酰胺（100X）

磷酸盐缓冲液PBS（-）

胎牛血清

凝聚胺
实验设备

10-cm的细胞培养皿

50毫升锥形离心管

Steriflip-GP过滤器（0.22微米）
超离心管17.0mL

5％二氧化碳培养箱

荧光显微镜

生物安全柜

离心机

 
实验材料

2.5M氯化钙溶液：36.75克氯化钙，70毫升双蒸H 2 O，通过0.22μm滤膜过滤，体积调制100毫升

2X HEPES缓冲：氯化钠280 mM，50mM肝素钠，1.5mM的Na2 HPO4 (pH值7.05）
实验步骤

腺病毒载体的构建和浓度

第1天： HEK细胞的培养

1．收集预融合的HEK 293T细胞，细胞培养于*DMEM培养基中（含10％FBS，50 U/ml的青霉素G和50μg/mL链霉素的，pH值7.35）。

2．将收集的浓度为1×106 的HEK 293T细胞接种于直径10cm的培养皿中，加入10mL*DMEM培养基。漩涡震荡使细胞均匀分布， 37℃培养24h。

第2天：转染

3．观察第1天培养的细胞，细胞应铺满约60％。

注意：细胞长满80％会导致收获病毒时PH偏低。

4．更换DMEM培养基（10％FBS，10mL），继续孵育于二氧化碳培养箱30min。

5．将10µg腺病毒转移载体与10µg包装混合物混合，用无菌ddH2 O稀释质粒至总体积450μL。

6．向质粒中加入50μL 2.5 M氯化钙混匀，然后加入500μl 2xHEPES缓冲液，涡旋。

7．将所有的转染混合物加入（散开）培养板，轻轻震荡，继续培养于5％二氧化碳培养箱过夜（16h）。

第3天：观察细胞和更换培养基

8．观察细胞

注意：细胞不能达到饱和状态，应该有供细胞分裂生长的空间，因为细胞铺满后培养基的pH值会迅速下降。

9．吸出培养基，加入5mL预热的PBS（-）洗两次细胞，然后加入9.5mL新鲜培养液的DMEM培养基， 5％CO 2 培养箱继续培育，37℃过夜。

第4天：收获细胞和浓缩病毒颗粒

10．转染40h后收集上清液。

注意：收集时培养基颜色应该是红色的（酚红的颜色），（pH值7.20或更高）在这个pH值内病毒培养较好，因此，不要使用从第二次收获的细胞。为了获得优先转染胶质细胞的腺病毒载体，应使用病毒转染后2d或3d的细胞。此外，最好使用充足胎牛血清培养的细胞。

11．通过0.22微米的过滤器过滤，清除上清液中的细胞碎片。

12．超速离心浓缩病毒颗粒。4℃，用吊桶式转头离心上清120000xg，1.5h。将2个培养板（约18mL）的上清浓缩于一管。

13．倒掉上清液，沉淀几乎看不见。

14．用90μL PBS（-）重悬病毒颗粒。病毒悬浮液，可用于在体外和体内实验：但是，如果需要纯净级的质量，可通过如下步骤纯化病毒。

腺病毒载体滴度的测定

腺病毒载体的滴度通过HeLa细胞的转染来测定。虽然滴度可以在13步后就可以计算，但为了缩短整个过程我们通常从第3天开始计算。

第3天：HeLa细胞播种

15．将 1×105 的的HeLa细胞接种于含1mLDMEM培养基（10％FBS）的12孔板，添加聚凝胺至浓度为6 µg/ml。在5％CO2 培养箱孵育，37℃过夜。

第4天：腺病毒载体的感染HeLa细胞

16．用PBS 10倍梯度稀释的病毒（稀释从10 -3 到10 -6 ）。实际测试的范围将取决于病毒制剂的浓度。17．将每个梯度稀释的病毒加入单层生长的HeLa细胞，轻轻摇匀， 337℃培养。

第5-8天：腺病毒载体的滴度测定

18．细胞再生长3天（感染后总88h），绿色荧光蛋白染色后48h可见。然而，这个时间根据滴定用腺病毒载体和细胞株不同而有所不同。

19．检测标记细胞百分比：如果标记是绿色荧光蛋白，计数绿色荧光蛋白表达的细胞。

20．如前所述计算生物滴度（TU/ml，转染单位）。