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噬神經元的腺病毒載體的構建

更新時間:2021-07-13  |  點擊率:1037

實驗試劑


人類胚胎腎(HEK)293T細胞

腺病毒轉移載體質粒

腺病毒包裝載體PLP1,pLP2(之前),PLP / VSVG

DMEM培養基

青霉素,鏈霉素-谷氨酰胺(100X)

磷酸鹽緩沖液PBS(-)

胎牛血清

凝聚胺
實驗設備

 

10-cm的細胞培養皿

50毫升錐形離心管

Steriflip-GP過濾器(0.22微米)
超離心管17.0mL

5%二氧化碳培養箱

熒光顯微鏡

生物安全柜

離心機

 

 
實驗材料


2.5M氯化鈣溶液:36.75克氯化鈣,70毫升雙蒸H 2 O,通過0.22μm濾膜過濾,體積調制100毫升

2X HEPES緩沖:氯化鈉280 mM,50mM肝素鈉,1.5mM的Na2 HPO4 (pH值7.05)
實驗步驟


腺病毒載體的構建和濃度

第1天: HEK細胞的培養

1.收集預融合的HEK 293T細胞,細胞培養于*DMEM培養基中(含10%FBS,50 U/ml的青霉素G和50μg/mL鏈霉素的,pH值7.35)。

2.將收集的濃度為1×106 的HEK 293T細胞接種于直徑10cm的培養皿中,加入10mL*DMEM培養基。漩渦震蕩使細胞均勻分布, 37℃培養24h。

第2天:轉染

3.觀察第1天培養的細胞,細胞應鋪滿約60%。

注意:細胞長滿80%會導致收獲病毒時PH偏低。

4.更換DMEM培養基(10%FBS,10mL),繼續孵育于二氧化碳培養箱30min。

5.將10µg腺病毒轉移載體與10µg包裝混合物混合,用無菌ddH2 O稀釋質粒至總體積450μL。

6.向質粒中加入50μL 2.5 M氯化鈣混勻,然后加入500μl 2xHEPES緩沖液,渦旋。

7.將所有的轉染混合物加入(散開)培養板,輕輕震蕩,繼續培養于5%二氧化碳培養箱過夜(16h)。

第3天:觀察細胞和更換培養基

8.觀察細胞

注意:細胞不能達到飽和狀態,應該有供細胞分裂生長的空間,因為細胞鋪滿后培養基的pH值會迅速下降。

9.吸出培養基,加入5mL預熱的PBS(-)洗兩次細胞,然后加入9.5mL新鮮培養液的DMEM培養基, 5%CO 2 培養箱繼續培育,37℃過夜。

第4天:收獲細胞和濃縮病毒顆粒

10.轉染40h后收集上清液。

注意:收集時培養基顏色應該是紅色的(酚紅的顏色),(pH值7.20或更高)在這個pH值內病毒培養較好,因此,不要使用從第二次收獲的細胞。為了獲得優先轉染膠質細胞的腺病毒載體,應使用病毒轉染后2d或3d的細胞。此外,最好使用充足胎牛血清培養的細胞。

11.通過0.22微米的過濾器過濾,清除上清液中的細胞碎片。

12.超速離心濃縮病毒顆粒。4℃,用吊桶式轉頭離心上清120000xg,1.5h。將2個培養板(約18mL)的上清濃縮于一管。

13.倒掉上清液,沉淀幾乎看不見。

14.用90μL PBS(-)重懸病毒顆粒。病毒懸浮液,可用于在體外和體內實驗:但是,如果需要純凈級的質量,可通過如下步驟純化病毒。

腺病毒載體滴度的測定

腺病毒載體的滴度通過HeLa細胞的轉染來測定。雖然滴度可以在13步后就可以計算,但為了縮短整個過程我們通常從第3天開始計算。

第3天:HeLa細胞播種

15.將 1×105 的的HeLa細胞接種于含1mLDMEM培養基(10%FBS)的12孔板,添加聚凝胺至濃度為6 µg/ml。在5%CO2 培養箱孵育,37℃過夜。

第4天:腺病毒載體的感染HeLa細胞

16.用PBS 10倍梯度稀釋的病毒(稀釋從10 -3 到10 -6 )。實際測試的范圍將取決于病毒制劑的濃度。17.將每個梯度稀釋的病毒加入單層生長的HeLa細胞,輕輕搖勻, 337℃培養。

第5-8天:腺病毒載體的滴度測定

18.細胞再生長3天(感染后總88h),綠色熒光蛋白染色后48h可見。然而,這個時間根據滴定用腺病毒載體和細胞株不同而有所不同。

19.檢測標記細胞百分比:如果標記是綠色熒光蛋白,計數綠色熒光蛋白表達的細胞。

20.如前所述計算生物滴度(TU/ml,轉染單位)。

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