在我们的细胞实验中经常会用到质粒DNA,现在都用剂盒非常方便,而且菌体培养后,可以多管浓缩提取,提到的质粒量多,可以-20℃保存,以后用于酶切、转化等实验,可以提前跑个胶,只要不降解,就可以继续用,避免每次要用,都要培养一遍再提取一遍。
质粒DNA的提取
质粒多为一些双链、环状的DNA分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时MAX主要的DNA载体。
实验步骤
1.摇菌培养
1)将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。
2)置于37℃恒温培养箱,培养12-17h,待长出菌落。
3) 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基,编号标记。
4) 挑取单克隆菌团放置液体培养基,每个培养基放置1个菌落。
5) 37℃,180rpm,振荡培养过夜。
2.收获细菌并裂解
1) 离心扩增好的菌液,按说明书将菌液重悬,转入1.5ml离心管中。
2)用质粒小量抽提试剂盒,按说明书要求提取质粒。
3) 细菌高速离心1min,*去除上清。
4)加入250ulRB溶液,振荡器充分悬浮细菌。
5)加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次,使细菌裂解,室温,放置2min。
6)加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次,使之充分中和,室温,放置2min。
7)室温,1500rpm,高速离心15min。
8)将吸附柱放入收集管内,离心得到的上清转移至吸附柱,室温,15000rpm,高速离心30s。
9)弃废液,将吸附柱放入收集管,加入700ul WB溶液到吸附柱中,15000rpm,高速离心30s。
10)重复上一操作。
11)将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中,加30-50ul预热的Elution Buffer,室温,放置2min,高速离心1min。
12)样品进行电泳检测:1%琼脂糖凝胶电泳,上样量为2ul,紫外灯下观察,MAX明亮的带为超螺旋形式,可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。
3.质粒的纯化
1)将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中,加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。
2)加入2倍体积的无水乙醇,放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。
3)4℃,高速离心机14000rpm,离心20min.
4)弃去上清,70%乙醇洗2次。
5)空气干燥,可置超净工作台干燥。
6)加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀,即为质粒溶液。
7)紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。
测量OD260和OD280的值:质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数(μg/mL)。
10个常见问题
一.时间控制问题
裂解时间太长,加入溶液P2后裂解时间不应超过5 分钟;吸附时间不够;溶解时间不够都会导致质粒DNA提取实验失败。
二.大肠杆菌老化
建议涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。
三.质粒拷贝数低
由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低,可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
四.溶液使用不当
溶液P2、P3 在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃培养箱保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。
五.吸附柱过载
不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如TB 或者 ×YT 菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率,则需调整LB 培养液体积。
六.质粒未全部溶解
洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
七.乙醇残留
漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。
八.洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会*覆盖硅胶膜的表面达到MAX大洗脱效率。
九.洗脱液不合适
DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱。洗脱效率取决于pH 值。MAX大洗脱效率在pH7.0~ 8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内,如果pH 过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脱效率。
十.洗脱体积太小
洗脱体积对来回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
以上内容仅供参考!
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