间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，在体外一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。

如何做好干细胞诱导分化？

成骨

1. 接种hMSC：用MSC Attachment solution 预包被24孔盘，每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF，接种6x104细胞 (3x104cells/Cm2)。

（注意：若使用其他培养器皿，请适当调整体积。)

2. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养。

3. 分化：培养24h后即细胞融合度达到80%时，将MSC NutriStem® XF 培养基吸除，每孔加入0.5ml分化培养基。

（注意：若细胞融合度<80%，继续再培养一天。）

4. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养10-21天，每2-3天换液。

（注意：培养时间越长，越容易矿化，ARS染色更明显。）

5. 成骨评价：使用2%的ARS染色液。

成脂

接种hMSC

1. 用MSC Attachment solution 预包被24孔盘，每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF，接种6x104 细胞 (3x104 cells/cm2)。注意：若使用其他培养器皿，请适当调整体积。

2. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养。

分化

1. 培养24h后即细胞融合度达到80-90%时，将MSC NutriStem® XF 培养基吸除，每孔加入0.5ml分化培养基。

注意：若细胞融合度<80%，继续再培养一天。

2. 置于37°C，5%CO2培养箱中培养14-21天，参照以下建议的替代培养基。

根据hMSC类型的替代培养基方法

不同来源的hMSC具有不同的多向分化潜能。例如，hMSC-AT需要较短的诱导期(~ 6天)，而比hMSC-BM和hMSC-CT需要10天诱导期。

注意：对于所有不同类型的hMSC，诱导成脂后建议使用维持培养基。避免将液体直接加入到脂肪细胞上，需要非常小心移液，因为脂肪细胞是脆弱的。

hMSC-AT:

一个分化周期/维持培养基

6-8天使用*成脂分化培养基，建议每3-4天换液。

成脂诱导完成后，用维持培养基MSC NutriStem® XF替代分化培养基，培养3-4天。

hMSC-BM:

一个分化周期/维持培养基

8-12天使用*成脂分化培养基，建议每3-4天换液(0.5 ml/well)。

成脂诱导完成后，用维持培养基(MSC NutriStem® XF替代分化培养基，培养3-4天。

hMSC-CT:

至少两个分化周期/维持培养基

5-10天使用*成脂分化培养基，建议每3-4天换液(0.5 ml/well)。

成脂诱导完成后，用维持培养基替代分化培养基，培养3-6天，每2-4天换液。

重复培养周期直到观测到成熟脂肪细胞（即脂滴的形成）。

成软骨

1. 接种hMSC，3D培养在 96-well U-bottom培养板中每孔加入100μl MSC NutriStem® XF，接种1x105细胞 (30-40x104 cells/cm2)。无需预包被。

注意：微量培养技术也是一个选择并且可以激发球形细胞的形成：接种10μl 1x104cells/ml 入板的中心（MAX终1x105cells/well），使其贴壁2小时，然后加入培养基0.1ml/well。

2. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养。在24-48小时内会自发形成球状体。

3. 分化：培养24小时后，将MSC NutriStem® XF培养基吸除，每孔加入0.2ml分化培养基。

4. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养14-21天。

注意：培养时间长，将得到更成熟的软骨细胞（Alcian Blue染色强度更大）。

5. 每3-4天更换分化培养基（0.2ml/well）。

注意：小心不要吸入球状体。

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